Обработка клинического материала и выделение нуклеиновых кислот – первый и важнейший этап молекулярно-биологического исследования. Основной задачей данного этапа является получение очищенного препарата ДНК для последующей реакции амплификации.
Генетический материал хранится в ядрах клеток, которые нужно разрушить, иначе ДНК не выйдет в раствор и будет недоступна для анализа.
Чтобы анализ прошел успешно, важно очистить ДНК от примесей. Примеси ингибируют активность ферментов, которые нужны для подготовки образка к анализу на секвенаторе или чиповом анализаторе.
Как происходит выделение ДНК из биологического материала?
- Разрушение мембран клеток и клеточных ядер, чтобы все содержимое клетки — ДНК, белки, липиды и сахара — вышло в раствор. Для этого используем лизисный буфер с детергентом SDS (для слюны) или тиоцианатом гуанидина (для крови). Детергент разрушает мембраны, а буферный компонент раствора поддерживает pH на оптимальном для ДНК уровне.
-
Удаление белков. Вышедшую в раствор ДНК нужно освободить от связанных с ней белков. Одновременно с этим необходимо инактивировать ДНКазы — ферменты, которые атакуют «оголенную» ДНК. За разрушение клеточных белков отвечает еще один компонент лизисного буфера — протеина К, фермент, который получают из микроскопических грибов рода Engyodontium album.Буква К в названии указывает на способность расщеплять кератин, белок ногтей и волос.
-
Отделение ДНК от примесей. Центрифугируем раствор в пробирках с кремниевой мембраной, которая связывается с ДНК и пропускает остальные органические компоненты клетки. Центрифугирование многократно увеличивает скорость фильтрации сквозь мембрану. Мембрану со связанной ДНК несколько раз промывают спиртом — изопропанолом или этанолом.